STERILISASI ALAT DAN MEDIA KULTUR JARINGAN TANAMAN

STERILISASI ALAT DAN MEDIA KULTUR JARINGAN

A.    Tujuan

1.      Mengetahui metode sterilisasi alat

2.      Mengetahui metode sterilisasi media kultur

3.      Sterilisasi alat-alat kultur jaringan

4.      Sterilisasi media kultur MSo dan ½ MS

B.     Waktu Pelaksanaan

Hari, tanggal        : Senin 26 Maret 2018

Pukul                    : 10.00- 15.00

Tempat     : Laboratorium Kultur Jaringan

C.    Landasan Teori

Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian-bagian tumbuhan serta menumbuhkannya dalam kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tumbuhan utuh kembali. Kultur jaringan tumbuhan adalah salah satu bentuk bioteknologi. Proses kultur jaringan tumbuhan didasarkan atas tiga kemampuan dasar tumbuhan, yaitu totipotensi, dediferensiasi, rediferensiasi dan kompetensi (Rahayu, 2018).

Pada metode kultur jaringan terdapat beberapa tahapan. Beberapa tahapan tersebut adalah sterilisasi alat dan media kultur jaringan. Sterilisasi adalah proses untuk mematikan atau menonaktifkan spora dan atau mikroorganisme sampai ke tingkat yang tidak memungkinkan menjadi sumber kontaminan selama tahap-tahap kultur jaringan. Sterilisasi eksplan pada prinsipnya adalah mematikan mikroorganisme kontaminan  tetapi jaringan eksplan tidak ikut mati. Setiap jenis organ tanaman memerlukan perlakuan khusus mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang berbeda sehingga sebelum mengulturkan tanaman baru perlu melakukan percobaan sterilisasi (Rahayu, 2018).

Pada kultur jaringan semua alat, bahan, eksplan, dan ruang kerja harus dalam keadaan aseptik. Keadaan ini untuk mengurangi kemungkinan kontaminasi. Oleh karena itu perlu sterilisasi. Alat-alat yang biasanya dipakai untuk kultur dan harus disterilsasi adalah botol kultur, petridish, skapel, pinset dan pisau pemes (Nursetiadi, 2008). Sebelum digunakan, alat-alat tersebut diusahakan tetap terbungkus kertas HVS sebelum digunakan (Marlina, 2004).

Alat-alat yang tahan panas dan akuades disterilkan menggunakan autoklaf pada suhu 121^oC selama 30 menit dan yang tidak tahan panas disterilkan dengan menggunakan alkohol 70%. Media MS yang akan digunakan disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC selama 15 menit (Fitri, 2012).

Alat-alat yang harus disterilkan yaitu botol kultur, petridisk, skapel, pinset dan pisau pemes. Alat-alat tersebut dicuci sampai bersih dengan menggunakan sabun cuci kemudian dikeringkan. Setelah kering, baru dimasukkan ke dalam autoklaf pada tekanan 1,5 psi (kg/cm2), pada suhu 120 0C selama 45 menit (Nursetiadi, 2008)

D.    Metode

a.       Alat:

botol kultur dan tutupnya

Autoclaf

Kompor

Baki

Erlenmayer 1000 ml

Pengaduk

Gelas ukur

Timbangan analitik

Teko

Skalpel

Pinset

Petridisk

Karet gelang penti

b.      Bahan :

Media yang sudah dimasukkan dalam botol kultur    

Aquades

Kertas bekas

Plastik

c.   cara kerja

sterilisasi alat

1. Botol kultur ditata rapi dalam autoklaf
2. Bungkus cawan petri, alat tanam (pinset dan scapel) dengan kertas polos, kemudian dibungkus lagi dengan plastik tahan panas
3. Sterilkan dalam autoklaf pada suhu 121º C selama 1 jam
4. Setelah selesai, alat-alat steril diletakkan kedalam ruang penanaman.

    sterilisasi aquades

1. Aquades dituang dalam botol kultur, ditutup
2. Botol ditata rapi dalam autoklaf dan disterilisasi pada suhu 121º C selama 1 jam
3. Setelah selesai, alat- alat dimasukkan dalam ruang penanaman

sterilisasi media

1. Botol kultur yang sudah diisi media, ditutup rapat dan diberi label (label berisi nama media dan tanggal pembuatan media)
2. Botol-botol media ditata rapi dalam autoklaf, disterilisasi pada suhu 121º C selama 20 menit
3. Setelah 20 menit, pemanasan dihentikan. ketika suhu sudah turun media dikeluarkan dan disimpan dalam ruang inkubasi selama 4-5 hari

E. Hasil

Botol kultur langsung dimasukkan dalam autoklaf tanpa dibungkus.

Hasil: botol kultur steril

Cawan petri dibungkus kertas polos dan dibungkus plastik, kemudian diikat dengan karet gelang pentil.

Hasil: petri disk steril, karena petri tidak ada yang terkontaminasi jamur atau bakteri.

Skalpel dan pinset dibungkus kertas polos dan dibungkus plastik, kemudian diikat dengan karet gelang pentil.

Hasil: Skalpel dan pinset steril, karena tidak ada yang terkontaminasi jamur atau bakteri.

Aquades dimasukkan dalam botol kultur.

Hasil: aquades steril

Enam dari 120 media yang dibuat terkontaminasi jamur 


F. Pembahasan 

Salah satu karakteristik kultur jaringan tumbuhan adalah aseptik. Oleh karena itu, sebelum melakukan kultur jaringan, harus dilakukan sterilisasi alat-alat, media dan eksplan. Pada penelitian Farida (2017) persiapan yang dilakukan untuk kultur jaringan tumbuhan adalah sterilisasi alat-alat yang akan digunakan. Pada praktikum sterilisasi alat-alat dan media kultur jaringan tumbuhan umumnya memiliki cara kerja yang sama tetapi memiliki perbedaan waktu. Sterilisasi yang telah dilakukan menggunakan alat autoklaf. Jika sterilisasi berlangsung dengan baik, maka tidak akan terjadi kontaminasi oleh bakteri dan jamur.

Autoklaf yang sederhana menggunkan sumber uap dari pemanasan air dalam autoklaf. Pada autoklaf sederhana  tekanan dan temperatur diatur dalam jumlah panas dari api. Dalam waktu 10-15 menit hampir semua sel-sel mikroba dapat terbunuh oleh uap air yang sangat panas. Permasalahan dalam sterilisasi menggunakan autoklaf yaitu jika tekanan dalam autoklaf diturunkan hingga tekanan udara luar sebelum suhu cairan turun sampai 100º C, cairan akan mendidih dan meluap dan meluap dari botol.

Botol kultur biasanya memiliki sedikit kemungkinanan sebagai penyebab kontaminasi, karena beberapa kali diautoklaf yaitu ketika sterilisasi alat dan sterilisasi media. Botol-botol kultur disterilisasi selama 1 jam, sehingga sangat efektif untuk membunuh mikroba. Tetapi pada penelitian Fitri (2012) untuk mengterilkan alat-alat yang tahan panas disterilisasi selama 30 menit.  Botol kultur yang tidak steril biasanya ditandai dengan terkontaminasinya pada dinding-dinding botol dan akan terlihat ketika sudah memasuki ruang inkubasi.

Cawan petri adalah alat untuk wadah eksplan. Pinset adalah alat untuk menjepit/pemegang eksplan, skalpel adalah alat untuk  memotong eksplan dengan pisaunya. Alat-alat tersebut ketika disterilisasi harus dibungkus dengan kertas. Tujuannya adalah untuk menjaga sterilnya alat sebelum digunakan dan memudahkan penyimpanan alat. Hal tersebuat juga dilakukan oleh Marlina (2004) dalam penelitiannya dalam mengkultur biji Anthurium. cawan petri terdiri dari 2 tangkup sehingga penyimpanan dan sterilnya petri dapat dijaga dengan dibungkus dengan kertas. Kertas yang digunakan tidak boleh ada tulisan/tinta pada salah satu sisinya atau sisi dalam yang digunakan untuk membungkus karena tinta tersebut dapat menempel pada alat-alat dan sangat sulit untuk dibersihkan.  Selain dibungkus dengan kertas, perlengkapan ini juga dibungkus dengan plastik tahan panas. Tujuannya adalah untuk menjaga kertas pembungkus tidak basah dan rusak ketika terkena uap air dalam sutoklaf ketika sterilisasi alat.

Aquades adalah pelarut yang biasa digunakan untuk melarutkan ketika membuat media atau digunakan ketika sterilisasi eksplan. Ketika akan digunakan untuk membuat media, aquades tidak harus disterilisasi karena akan disterilisasi bersama media. Tetapi, ketika akan digunakan untuk sterilisasi eksplan harus disterilisasi. Karena dapat mempengaruhi sterilnya eksplan yang akan dikultur. Aquades disterilisasi selama 1 jam dengan autoklaf pada suhu 121 º C.

Sterilisasi media harus dilakukan. Perpedaan dalam sterilisasi alat dan media adalah waktu sterilsasi. Waktu sterilisais media adalah 20 menit. Tujuannya adalah untuk mengsterilkan media tapi tidak merusak  makronutrien dan mikro nutrien.  Kontaminasi media dapat terlihat mulai pada hari ke 4 setelah sterilisasi, oleh karena itu, setelah sterilisasi sebaiknya media tidak langsung digunakan. Media yang terkontaminasi ditandai dengan munculnya koloni jamur dan bakteri pada permukaan atas media.

G.     Kesimpulan

Pada tektik kultur jaringan terdapat tahap sterilsasi. Tujuannya adalah untuk membunuh mikroba dan jamur sehingga tidak terjadi kontaminasi. Pada proses sterilisasi, membutuhkan suhu yang sama yaitu 121 ^o C tetapi membutuhkan waktu yang berbeda. Alat-alat kultur dan aquades membutuhkan waktu 1 jam sedangkan media hanya butuh 20 menit sterilisasi. Beberapa alat-alat kultur jaringan membutuhkan perlakukan husus sebelum sterilisasi yaitu petri disk, pinset dan skalpel harus dibungkus dengan kertas dan dibungkus lagi dengan plastik tahan panas.

Daftar pustaka

Farida, Fitriana ilma, W. Muslihatin. 2017. Induksi Perakaran Teh (Camellia sinensis L.) Secara In Vitro pada Klon yang Berbeda. Jurnal Sains Dan Seni Pomits. Vol. 6(2): 80-85

Fitri, M. Satria, dkk. 2012. In-Vitro Effect of Combined Indole Butyric Acid (IBA) and Benzil Amino Purine (BAP) on the Planlet Growth of Jatropa curcas L. Jurnal Natural. Vol. 12 (1). 27-31.

Marlina, Nina. 2004. Teknik Perbanyakan Anthurium dengan Kultur Jaringan. Buletin Teknik Pertanian. Vol. 9(2): 73-75

Nursetiadi, eka. 2008. Kajian Macam Media Dan Konsentrasi BAP Terhadap Multiplikasi Tanaman Manggis (Garcinia mangostana L.) Secara In Vitro (skripsi). Fakultas Pertanian Universitas Sebelas Maret Surakarta: Surakarta.

Rahayu, Enni Suwarsi. 2018. Bahan Ajar Kultur Jaringan. Fakultas Matematika Dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri  Semarang: Semarang